使用no-SCAR系統完成大腸桿菌的基因組編輯

【背景】

CRISPR-Cas9作為一種應用廣泛的基因組編輯技術可對各物種的基因組進行高效、準確的修飾。Cas9核酸內切酶可以造成DNA雙鏈斷裂，通過同源重組和非同源末端連接兩種途徑對基因組進行修復，實現基因組堿基的缺失或插入，最終完成精準的基因修飾。在大腸桿菌細胞中需要λ-Red系統完成斷裂基因組的修復，因此no-SCAR（Scarless Cas9 Assisted Recombineering）系統使用λ-Red方法促進基因組重組外源DNA和Cas9介導的雙鏈DNA切割對野生型細胞進行選擇，同時質粒系統無需染色體標記。這種no-SCAR系統可以對基因組的多個位點進行點突變、基因刪除和短序列的插入，能夠高效、無痕的一步完成，為微生物基因組研究提供了快速、有效的方法。

【方法】

Cas9質粒系統包含PTET啟動子，控制Cas9基因表達的ssrA標簽和增加負調節表達的tetR啟動子，可以嚴格控制Cas9質粒的轉錄。sgRNA質粒系統包含gam、bet、exo基因，這些基因表達的λ-Red重組系統可以幫助大腸桿菌基因組進行重組。兩個質粒系統包含基因組修飾所需的所有元件，無宿主特異性。

【結論】

  1. 構建的Cas9和sgRNA表達質粒包含了大腸桿菌基因組修飾的所有元件，無宿主特異性，可對基因組任何位點進行點突變、基因組敲除/敲入；
  2. ropB基因516位點的錯義點突變對利福平藥物產生抗藥性；
  3. 利用71bp長度的引物成功刪除了ack基因的1,095bp長度的序列
  4. 在pfkA基因中成功插入79bp長度的ssA標簽；
  5. 將細胞分別在基本培養基和無氯霉素培養基上37℃過夜培養后，克隆細胞只在基本培養基上生長。由此說明，no-SCAR質?？梢栽诨蚪M編輯完成后被移除，不會對后續基因組編輯操作造成影響。

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參考文獻

Reisch, C.R. and K.L. Prather, The no-SCAR (Scarless Cas9 Assisted Recombineering) system for genome editing in Escherichia coli. Sci Rep, 2015(5) :p. 15096.