【背景】
CRISPRi技術是在CRISPR-Cas9基礎上，將Cas9蛋白改造成為不具有切割活性的dCas9，在sgRNA的介導下仍可以靶向基因組序列。CRISPRi技術能夠有效的抑制編碼基因和非編碼基因的表達，并可同時對多個基因進行調控且無脫靶率。CRISPRi技術的出現為研究基因的功能提供了高效的新方法。
【方法】
設計dCas9結構包括兩個突變體RuvC1-和HNH-。sgRNA包含三個部分：20nt用于與匹配目標序列，42nt用于與Cas9結合，40nt為轉錄終止結構。針對mRFP基因編碼序列不同區域設計sgRNA，用于檢測dCas9能否高效抑制基因表達。
【結論】
- CRISPRi技術能夠抑制轉錄起始和延伸，靶向非模板鏈DNA的dCas9-sgRNA會產生有效的沉默；靶向模板鏈DNA的dCas9-sgRNA效果不明顯，dCas9-sgRNA結構靶向啟動子區域能夠造成有效的基因沉默；
- CRISPRi基因抑制過程是可逆的。 dCas9-NT1受 aTc啟動子控制，隨著時間的延長，mRFP蛋白熒光量先降后升，最后會恢復到與陽性對照相同的水平，由此說明CRISPRi基因敲除是一個可逆的過程；
- 在目標位點上游轉錄暫停，暫停位點與目標位點之間長度為19bp堿基，由此得知CRISPRi通過抑制轉錄過程對基因表達進行調節；
- CRISPRi sgRNA沉默是高特異性的，對全基因組范圍內的mRNA序列測序得知，sgRNA（NT1）靶向mRFP基因后，mRFP基因是唯一轉錄豐度降低的基因，沒有其他基因顯示出明顯的基因表達量的變化；
- CRISPRi能夠同時調節多個基因，設計兩個sgRNA分別靶向mRFP基因和sfGFP基因，CRISPRi系統可將兩個基因同時敲除，由此說明CRISPRi系統可以同時對多基因進行調節；
- 決定CRISPRi沉默效率的因素：sgRNA長度、與目標序列的重合度以及sgRNA的位置CRISPRi抑制的效果與目標位點與起始位點之間的距離呈反比例相關，一般情況下，sgRNA與基因組序列有20bp重復序列用于靶向目標序列，而通過實驗數據可以得知基因沉默所需匹配序列的最短長度是12bp；sgRNA的最初7nt堿基區域對于基因沉默具有重要作用；使用兩個sgRNA靶向同一個基因，可以提高CRISPRi的效率，但是，如果兩個sgRNA具有重疊效應時，可能會降低CRISPRi的效率；
- CRISPRi技術可應用于內源性的基因網絡。針對大腸桿菌乳糖表達途徑上的相關基因設計sgRNA，結果可以得知，LacZ基因的表達量受到抑制，而LacI基因則被激活，表達量有所增加。由此說明CRISPRi技術可以提供一個快速、有效的方法來驗證基因網絡中各個基因的功能；
- CRISPRi技術在人類細胞中也同樣適用，可對人類HEK293細胞系中的基因表達造成抑制。
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參考文獻
Qi, L.S., et al., Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression. Cell, 2013. 152(5): p. 1173-83.