根據靶基因可以設計多對gRNA，不同的gRNA介導的Cas9對DNA的切割效率不一致，因此在利用CRISPR-Cas9建立基因敲除或敲入動物前需要先對gRNA進行活性驗證，選取能夠介導更高切割效率的gRNA。泓迅科技可以提供三種gRNA活性檢測方法: SSA活性檢測、體外切割活性驗證和內源性活性切割。
SSA活性檢測
單鏈復性(Single-strand annealing，SSA)檢測，可以驗證打靶質粒是否具有切割裸露DNA的能力，是初步評估CRISPR-Cas9系統有活性的一種常用的方法。在SSA報道質粒中含有兩個不具有活性的熒光素酶(luciferase)編碼片段，在兩者中間含有一個終止密碼子和一段gRNA的靶序列。當CRISPR-Cas9能對靶序列進行有效切割形成DNA雙鏈斷裂(Double strand breaks，DSBs)，細胞通過SSA機制對DNA序列進行同源重組修復，從而重新形成有活性的熒光素酶基因，之后通過熒光檢測就可以預測CRISPR-Cas9的切割活性。
體外切割活性驗證
CRISPR-Cas9系統的剪切活性與sgRNA靶點識別序列相關。每個sgRNA靶點識別不同，剪切活性也有所差異，因此需要篩選出切割效率最高的sgRNA。體外檢測sgRNA活性檢測：使用Cas9體外酶切靶點DNA序列，獲得的兩條DNA片段。通過瓊脂糖電泳分析，觀察gRNA介導的DNA被切割的百分比，從而判斷gRNA的活性和切割效率。
內源活性檢測
Surveyor 法即錯配內切酶檢測法，采用T7E1內切酶。在靶點兩側設計合適的引物，PCR擴增出含有錯配突變位點的DNA條帶。T7E1內切酶可以識別并切割錯配的雜合DNA雙鏈。將酶切產物通過瓊脂糖電泳分析可以初度估計切割條帶與未切割條帶的比例，從而反應出CRISPR-Cas9的活性。
活性檢測服務內容詳情：
| 服務名稱 | 產品/服務內容 | 交付周期 | 交付項目 | 價格 |
|---|---|---|---|---|
| SSA活性檢測 | 1.gRNA靶點引物設計與合成 2.pSSA-luc載體構建 3.細胞轉染 |
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| 體外切割活性驗證 | 1.體外轉錄gRNA 2.CRISPR-Cas9體外酶切反應 |
咨詢 | 檢測報告 | 咨詢 |
| 內源活性檢測 | 1.基因組提取 2.靶點引物設計 3.T7E1酶切反應 |
咨詢 | 檢測報告 | 咨詢 |
| 服務項目 | 區別 |
|---|---|
| SSA活性檢測 | 設計簡單、操作容易、經濟有效。 |
| 體外切割活性檢測 | 只需靶點設計，即可進行驗證；無需細胞平臺支持，EP管內就能實現，成本較低廉。 |
| 內源活性檢測 | 篩選周期短，可加快驗證流程。 |
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